METODE CAWAN AGAR UNTUK MENGHITUNG MIKROORGANISME TANAH

I.         PENDAHULUAN

1.1.  Latar Belakang

Jumlah total mikroorganisme yang terdapat di dalam tanah digunakan sebagai indeks kesuburan tanah tanpa mempertimbangkan hal-hal lain. Tanah yang subur mengandung banyak mikroorganisme tanah karena populasi yang tinggi menggambarkan adanya suplai makanan dan energy yang culup, serta kondisi ekologi lain yang mendukung perkembangan mikroorganisme tanah tersebut. Dengan kata lain, untuk mengetahui tingkat kesuburan tanah dapat dilakukan dengan cara menghitung jumlah populasi mikroorganisme yang ada.

Menurut Waluyo (2007), pengamatan bakteri dapat dilakukan secara individual maupun secara kelompok dalam bentuk koloni. Bila bakteri yang ditumbuhkan dalam medium yang tidak cair, maka akan terjadi suatu kelompok yang dinamakan koloni. Bentuk koloni berbeda-beda untuk setiap spesies, dan bentuk tersebut merupakan cirri khas bagi suatu spesies, dan bentuk tersebut merupakan cirri khas bagi suatu spesies tertentu.

Prinsip dari metode hitungan cawan adalah menumbuhkan sel mikroba yang masih hidup pada media agar, sehingga sel mikroba tersebut akan berkembang biak dan membentuk koloni yang dapat dilihat langsung dengan mata tanpa menggunakan mikroskop. Metode hitungan cawan dapat dibedakan atas dua cara, yaitu metode tuang dan metode sebar (Fardiaz,1993).

1.2.  Tujuan

Adapun tujuan dilakukan praktikum kali ini adalah :

1.      Mengetahui prinsip penetapan metode hitungan cawan

2.      Mengetahui cara pembuatan seri pengenceran

3.      Mengetahui prosedur pembuatan agar nutrient untuk bakteri tanah dan fungi tanah

4.      Mengetahui cara atau prosedur mengisolasi mikroorganisme

II.      METODELOGI PERCOBAAN

2.1. Alat dan Bahan

Adapun alat yang digunakan pada praktikum kali ini adalah Erlenmeyer, tabung reaksi, autoklaf, timbangan, pipet dan incubator.

Sedangkan bahan yang digunakan adalah NaCl, Aquades, sampel tanah, kapas, aluminium foil, pepton, beef extract, agar, glukosa, K₂HPO₄, KNO₃, ekstrak tanah, PDA, rose Bengal, streptomisin dan label.

2.2.Langkah Kerja

Prosedur kerja yang dilakukan selama praktikum adalah:

A.    Pembuatan seri Pengenceran

Membuat larutan fisiologis

Memasukkan 90 ml larutan fisiologis ke dalam Erlenmeyer

Memasukkan 9 ml larutan fisiologis pada tabung reaksi

Menyiapkan sampel tanah sebanyak 7 tabung reaksi

Menutup Erlenmeyer dan tabung reaksi dengan kapas, sebelumnya menutup kapas dengan aluminium foil

Mengautoklaf Erlenmeyer dan tabung reaksi selama 20 menit pada temperature 1210 C

Mendinginkan larutan tersebut sampai suhu antara 42-450C

Menimbang 10 gram sampel tanah dan memasukkannya dalam Erlenmeyer yang berisi 90 ml larutan fisiologis, kemudian mengocoknya secara perlahan

Memipet larutan tersebut sebanyak 1 ml dan memasukkannya ke tabung reaksi berisi 9 ml larutan fisiologis selanjutnya mengocoknya

Memindahkan 1 ml larutan 10-3 ini ke dalam 9 ml larutan fisiologis selanjutnya hingga pengenceran 10-8

B.     Pembuatan Medium Biakan Bakteri Tanah

Melarurkan masing-masing bahan dalam Erlenmeyer

Meyeterilkan medium dalam autoklaf dengan temperature 1210 C selama 15 menit

C.     Pebuatan Medium Biakan Fungi Tanah

Melarutkan masing-masing bahan dalam Erlenmeyer

Mengautoklaf medium

Mendinginkan sampai suhu 50-550 C

D.    Isolasi Mikroorganisme

Mengambil 1 ml larutan tanah dari serial pengeneran 10-4 sampai 10-8

Memasukkannya dalam cawan petri steril

Menuangkan kurang lebih 12-15 ml medium biakan ke cawan petri berisi 1 ml larutan tanah

Memberi label pada masing-masing cawan petri

Membalik cawan bila agar memadat

Menginkubasi biakan mikroorganisme pada suhu ruang

III.             HASIL PENGAMATAN DAN PEMBAHASAN

3.1.Hasil Pengamatan

Tabel 1 Pengamatan Koloni bakteri

No	Seri Pengenceran	Gambar	Jumlah Koloni
1	10-4		140
2	10-5		121
3	10-6		80
4	10-7		77
5	10-8		47

Tabel 2. Pengamatan Koloni Jamur

Seri Pengenceran	Nama Jamur	Gambar	Jumlah Koloni	Ciri-ciri
10-3	Aspergillus niger		4	Berwarna hitam mebentuk bulatan tak beraturan
	Azospirillium sp		6	Hifa berwarna putih dan membentuk lingkaran
10-4	Aspergillus niger		1	Berwarna hitam mebentuk bulatan tak beraturan
	Azospirillium sp		1	Hifa berwarna putih dan membentuk lingkaran
10-5	-          (kontaminan)		-
10-6	Aspergillus niger		15	Berwarna hitam mebentuk bulatan tak beraturan
	Azospirillium sp		2	Hifa berwarna putih dan membentuk lingkaran

3.2.  Pembahasan

Praktikum kali ini adalah mengenai perhitungan mikrooorganisme tanah dengan menggunakan metode cawan agar, sehingga akan memperoleh hasil pendugaan jumlah mikroorganisme tersebut. Langkah pertama yang harus dilakukan adalah membuat seri pengenceran. Hal yang dilakukan adalah mencampurkan 10 g sampel tanah dengan 90 ml larutan fisiologis dalam Erlenmeyer. Campuran tersebut terus diaduk hingga tanah tercampur dengan larutan. Kemudian didiamkan sebentar agar tanah mengendap dibawah sehingga ketika pengambilan larutan nantinya, sampel tanah tidak ikut terbawa.

Kemudian menyiapkan 7 tabung reaksi yang berisi 9 ml larutan fisiologis dan 7 pipet tetes. Setelah itu memasukkan 1 l larutan tanah ke dalam tabung reaksi dengan pipet tetes. Setelah dilakukan pencampuran maka diambil kembali 1 ml larutan tanah pada tabung tersebut dengan menggunakan pipet yang berbeda ketabung reaksi selanjutnya. Kegiatan tersebut dilakukan hingga mencapai tabung ke 7 dan diperoleh 7 seri pengenceran yaitu pengenceran 10^-2 sampai 10^-8 .

Pada dasarnya pengenceran ini dilakukan berdasarkan prinsip dari metode hitungan cawan yakni menganggap bahwa setiap sel yang dapat hidup akan berkembang menjadi 1 koloni dan koloni tersebutlah yang nantinya akan dihitung. Sehingga apabila tidak dilakukan pengenceran maka sejumlah koloni yang tumbuh akan sangat banyak dan tidak dapat dihitung serta jumlah koloni yang ada pada 1 cawan adalah berkisar antara 30-300 koloni saja.

Setelah dilakukan pengenceran, kemudian dilakukan isolasi mikroorganisme. Untuk menghitung total bakteri dipilih serial pengenceran 10^-4 sampai 10^-8 dan untuk menghitung total koloni jamur dipilih serial pengenceran 10^-3 sampai 10^-6 . Cara mengisolasinya adalah denga mengabil larutan tanah 1ml dari serial pengenceran tersebut kemudian dituangkan di cawan petri kosong yang selanjutnya dituangkan 12-15 ml medium biakan. Cawan tersebut kemudian diinkubasi dan disusun secara terbalik untuk mencegah jatuhnya uap air ke media, kemudian dilakukan pengamatan.

Setelah diperoleh data jumlah koloni dari pengamatan jumlah koloni bakteri, selanjutnya adalah menghitung jumlah mikroorganisme dari sampel tanah dengan menggunakan rumus sebagai berikut:

CFU = Jumlah koloni x Faktor Pengenceran

Sehingga didapati bahwa dikelompok dua pada;

Seri pengenceran 10^-4   = 140 x 10⁴ = 1.400.000

Seri pengenceran 10^-5 =121 x 10⁵ = 12.100.000

Seri pengenceran 10^-6  =85 x10⁶ = 85.000.000

Seri pengenceran 10^-7  =77x 10⁷ =770.000.000

Seri pengenceran 10^-8  =47x10⁸ = 4.700.000.000

Sedangkan pada pengaatan kedua yaitu menghitung populasi jamur dilakukan pada hari ke lima. Hal ini dikarenakan pertubuhan bakteri lebih cepat sehingga hanya dalam waktu 3 hari saja sudah mulai terlihat koloninya. Sedangkan pertumbuhan jaur lebih lambat.

Jamur yang diperoleh ada 2 macam yaitu jamur Aspergilus niger dan Azospirillium sp. Selain itu juga ditemukan 1 cawan yang terkontainasi dengan jaur lain sehingga kedua jamur tadi tidak dapat tumbuh. Ciri-ciri yang dapat dia,ati untuk menentukan apakah itu jamur Aspergilus niger adalah bahwa hifanya berwarna hitam berbintik-bintik dan bentuk koloninya membentuk bulatan tak beraturan. Sedangkan cirri-ciri jamur Azospirillium sp adalah hifanya berwarna putih dan membentuk lingkaran, sedangkan cirri-ciri jaur kontaminan adalah hifanya berwarna putih kekuningan dengan pinggiran berwarna merah muda dan lingkarannya berbentuk cembung.

Untuk perhitungan jumlah populasinya sama dengan pada bakteri yakni

CFU= julah koloni x factor pengenceran

Pengenceran 10^-3

   Aspergillus niger = 4 x 10³ = 4000

Azospirillium sp = 6 x 10³ = 6000

Pengenceran 10^-4

   Aspergillus niger = 1 x 10⁴ = 10.000

Azospirillium sp = 1 x 10⁴ = 10.000

Pengenceran 10^-6

   Aspergillus niger = 15 x 10⁶ = 15.000.000

Azospirillium sp = 2 x 10⁶ = 2.000.000

Aspergilus niger merupakan fungi dari filum ascomycetes yang berfilamen, mempunyai hifa berseptat, dan dapat ditemukan melimpah di alam.^[1]Fungi ini biasanya diisolasi dari tanah, sisa tumbuhan, dan udara di dalam ruangan. Koloninya berwarna putih pada Agar Dekstrosa Kentang (PDA) 25 °C dan berubah menjadi hitam ketika konidia dibentuk. Kepala konidia dari A. niger berwarna hitam, bulat, cenderung memisah menjadi bagian-bagian yang lebih longgar seiring dengan bertambahnya umur.

Aspergillus niger memiliki klasifikasi sebagai berikut:
Domain :Eukaryota
Kingdom :Fungi
Phylum :Ascomycota
Subphylum :Pezizomycotina
Class :Eurohomycetes
Ordo :Eurotiales
Family :Trichocomaceae
Genus :Aspergillus
Spesies :Aspergillus niger

A. niger dapat tumbuh optimum pada suhu 35-37 °C, dengan suhu minimum 6-8 °C, dan suhu maksimum 45-47 °C.^[1] Selain itu, dalam proses pertumbuhannya fungi ini memerlukan oksigen yang cukup (aerobik). A. niger memiliki warna dasar berwarna putih atau kuning dengan lapisankonidiospora tebal berwarna coklat gelap sampai hitam.

Dalam metabolismenya A. niger dapat menghasilkan asam sitrat sehinga fungi ini banyak digunakan sebagai model fermentasi karena fungi ini tidak menghasilkan mikotoksin  sehingga tidak membahayakan. A. niger dapat tumbuh dengan cepat, oleh karena itu A. niger banyak digunakan secara komersial dalam produksi asam sitrat, asam glukonat, dan pembuatan berapa enzim seperti amilase, pektinase, amiloglukosidase, danselulase.

Selain itu, A. niger juga menghasilkan gallic acid yang merupakan senyawa fenolik yang biasa digunakan dalam industri farmasi dan juga dapat menjadi substrat untuk memproduksi senyawa antioksidan dalam industri makanan.

A.niger dalam pertumbuhannya berhubungan langsung dengan zat makanan yang terdapat dalam substrat, molekul sederhana yang terdapat disekeliling hifa dapat langsung diserap sedangkan molekul yang lebih kompleks harus dipecah dahulu sebelum diserap ke dalam sel, dengan menghasilkan beberapa enzim ekstra seluler seperti protease, amilase, mananase, dan α-glaktosidase. Bahan organik dari substrat digunakan oleh Aspergillus niger untuk aktivitas transport molekul, pemeliharaan struktur sel, dan mobilitas sel.

Azospirillum sp.

Azospirillum sp. merupakan bakteri tanah penampat nitrogen nonsimbiotik. Bakteri ini hidup bebas di dalam tanah, yang berada disekitar atau dekat dengan perakaran. Dari hasil penelitian Azospirillum sp. memiliki banyak manfaat dalam tanah dan tanaman, sehingga sering digunakan sebagai biofertilizer. Bakteri ini digunakan sebagai  biofertilizer karena mampu menambat nitrogen 40-80% dari total nitrogen dalam rotan dan 30% nitrogen dalam tanaman jagung. Selain itu Azospirillum sp. dapat  menghasilkan beberapa hormon pertumbuhan hingga  285,51 mg/liter dari total medium kultur, sehingga dapat meningkatkan efisiensi pemupukan. Selain itu, Azospirillum sp. juga mempunyai  kemampuan merombak bahan oganik di dalam tanah. Bahan organik yang dimaksud adalah bahan organik yang berasal dari kelompok karbohidrat seperti selulosa, amilosa, dan bahan organik yang mengandung sejumlah lemak dan protein.

Sedangkan Azospirilum sp dapat tumbuh baik pada daerah tropika dan sub tropika dengan kisaran suhu 10°C-30°C
Kingdom :Bacteria
Kelas :Alpha protobacteria
Ordo :Rhodosphililales
Family :Rhodosphililaceae
Genus :Azospirilum
Spesies :Azospirilum sp

Azospirillum sp. sebagai penghasil fitohormon sangat berguna bagi tumbuhan karena dengan adanya fitohormon tersebut maka tanaman akan tumbuh dengan cepat. Fitohormon adalah hormon tumbuhan yang berupa senyawa organik yang dibuat pada suatu bagian tanaman dan kemudian diangkut ke bagian lain, yang dengan konsentrasi rendah menyebabkan suatu dampak fisiologis. Peran suatu hormon adalah merangsang pertumbuhan, pembelahan sel, pemanjangan sel, dan ada yang menghambat pertumbuhan. Fitohormon yang dihasilkan bakteri ini adalah auksin, sitokinin, giberelin dan etilen. Hormon-hormon ini berperan penting dalam pertumbuhan tanaman dan masing-masing memiliki fungsi yang berbeda-beda pada pertumbuhan suatu tanaman.

IV.   KESIMPULAN

Dari hasil pengamatan dan pembahasan tersebut, maka dapat diperoleh kesimpulan sebagai berikut:

1. Seri pengenceran perlu dilakukan agar jumlah populasi mikroba yang  dapat

    tumbuh tidak terlalu banyak

2. Jumlah koloni pada pengenceran 10-4 pada pengamatan bakteri paling banyak

     terus menurun pada seri-seri pengenceran selanjutnya

3. Jumlah koloni bakteri pada pengenceran 10-4 paling tinggi karena kepekatan  

    larutan tanahnya paling tinggi sehingga mikroba yang ada semakin banyak

4. Ditemukan 2 jenis fungio pada pengamatan ini yaitu Aspergillus niger dan  

      Azospirillium sp.

5.      Hifa A. niger berwarna hitam berbintik bintik karena konidianya cenderung

terpisah sedangkan hifa Azospirillium sp berwarna putih.

DAFTAR PUSTAKA

Anonim.2012. http//id.wikipedia.org/wiki/Aspergillus.niger.diakses pada 20

November 2012.

Akbar.2007. Isolationand Selection Of Inagenous Azospirillium sp and IAA of

Superior Strom On Wheat Roots. World Journal of Agriculture Sciences.

Fardian,S.19993. Analisis Mikrobiologi Pangan. Jakarta: PT Raja Grafindo Persada.

Waluyo,Lud.2007. Mikrobiologi Umum. Malang: UMM Press